Cílem projektu je studium interakcí proteinů, které se podílejí na eukaryotické transkripci, se zvláštním ohledem na roli růstového faktoru LEDGF (lens epithelium-derived growth factor) v regulaci genové transkripce. Dosud jsme odkryli molekulární mechanismy, které jsou základem interakcí LEDGF s dalšími transkripčními regulačními faktory, a zkoumáme jeho zapojení do proteinové regulační sítě řídící transkripční elongaci.
Kontakt: Vanda Lux, Eliška Koutná, Lisa-Maria Weinhold, Terézia Paulovčáková, Václav Veverka
Vícečetné rozpoznávání nukleosomů pomocí proteinu LEDGF
Eukaryotická transkripce je závislá na specifických modifikacích histonů. Jejich rozpoznání chromatinovými readery spouští složité procesy, které spoléhají na koordinovanou asociaci transkripčních regulačních faktorů. Ačkoli různé modifikační stavy konkrétního histonového residua často vedou k rozdílným výsledkům, není zcela jasné, jak jsou rozlišovány. Kromě toho, význam vnitřně neuspořádaných oblastí mimo specializované reader domény pro vazbu na nukleosom je dosud prozkoumán jen málo. Ve své práci přinášíme strukturu domény PWWP z transkripčního koaktivátoru LEDGF v komplexu s di- a trimetylovaným nukleosomem na H3K36, která naznačuje, že obě metylační značky jsou PWWP rozpoznávány vysoce konzervovaným způsobem. Identifikovali jsme specifické sekundární interakční místo pro doménu PWWP, které může přispívat k roli LEDGF nezávislé na metylaci H3K36. Odhalili jsme DNA interakční motivy ve vnitřně neuspořádané oblasti LEDGF, které rozlišují mezi intra- a extranukleosomální DNA, ale v kontextu dinukleosomů zůstávají dynamické. Vzájemné vztahy mezi H3K36 reader doménou PWWP a proteinovým vazebným modulem molekuly LEDGF zprostředkované vícečetnými interakcemi vnitřně neuspořádaného linkeru s chromatinem mohou pomoci nasměrovat elongační aparát do blízkosti RNA polymerázy II, a tím usnadnit produktivní elongaci.
Změny v afinitě interaktomu LEDGF/p75 IBD jsou řízeny fosforylací
Interakce vazebných partnerů LEDGF je strukturně konzervovaná. (A) Sekvenční alignment znázorňující konzervovaný vazebný motiv (IBM). (B) Detail rozhraní POGZ-LEDGF interakce (C) Dynamické struktury LEDGF v komplexu s vazebnými motivy z POGZ, JPO2, IWS1 a MLL1, stanovené pomocí NMR spektroskopie.
Leukémie se smíšeným fenotypem je závažným problémem s 50% mírou přežití u postižených dětí. Analýzou struktury proteinu LEDGF jsme identifikovali specifickou slabinu tohoto typu leukémie. Objevili jsme zásadní molekulární vlastnosti řídící interakce LEDGF s jeho vazebnými partnery, a odhalili tak dosud nepopsané interakce s hlavními transkripčními regulačními faktory. To prohlubuje naše znalosti o síti proteinů zapojených do transkripční elongace. Důležitým zjištěním je, že fosforylace zprostředkovaná kaseinkinázou 2 silně ovlivňuje vazbu mezi LEDGF a jeho partnery. Prokázali jsme, že odstranění fosforylovaných pozic u MLL1, interakčního partnera LEDGF, vede ke zmírnění rakovinného stádia leukemických buněk, aniž by to mělo vliv na normální funkce krevních buněk.
Struktura LEDGF dimeru. (A) Krystalová struktura swapovaného dimeru LEDGF. (B) Vyobrazení elektrostatických vlastností povrchu dimeru LEDGF odhaluje dvě symetricky umístěné, kladně nabité plochy na povrchu dimeru. (C) Konvergující struktury získané pro dimer (D) Struktura swapovaných domén je stabilizována sítí elektrostatických kontaktů.
LEDGF hraje klíčovou roli v připojování transkripčních regulátorů k chromatinu v kontextu normálním i patologickém. Předchozí studie naznačily, že dimerizace LEDGF je důležitá pro jeho roli v rozeznávání epigenetických značek. Přímý důkaz dimerizace LEDGF však chyběl. V naší práci jsme se zaměřili na zodpovězení tří klíčových otázek: (1) Může LEDGF/p75 tvořit dimery? (2) Jaký je minimální rozsah domény zodpovědné za dimerizaci? (3) Jaký je molekulární mechanismus dimerizace? Pomocí NMR spektroskopie, rentgenové krystalografie a dalších biochemických technik jsme odhalili molekulární podstatu tvorby LEDGF dimerů. Minimální oblast pro dimerizaci se skládá z vazebné domény pro integrázu a dynamické C-koncové části obsahující další helix, který stabilizuje dimer skrze elektrostatické interakce. Dimerizace neovlivňuje schopnost LEDGF interagovat s buněčnými partnery in vitro a může sloužit k lokálnímu zvýšení koncentrace interagujících faktorů, což zvyšuje míru aktivní transkripce. Usuzujeme, že LEDGF dimery fungují jako molekulární "lepidlo", které vzájemně propojuje stejné nebo různé interakční partnery, a zesiluje tak epigenetické signály v buňce.
Univerzální interakční modul neuspořádaných proteinů řídí transkripční elongaci
TFIIS N-terminální doména (TND) je konzervovaná struktura rozšířená mezi transkripčními elongačními faktory. Dynamické struktury různých TND domén určené pomocí NMR spektroskopie. Střední kvadratická odchylka (RMSD) a sekvenční identita mezi jednotlivými dvojicemi TND domén a strukturním alignmentem.
Bylo zjištěno, že nestrukturované oblasti v proteinových sekvencích, o nichž se dříve předpokládalo, že nemají žádnou funkci, mají ve skutečnosti důležitou biologickou roli. Zatímco jejich význam v signalizaci, lokalizaci a stabilitě bílkovin je dobře znám, jejich role v jiných souvislostech zůstávala neobjasněná. Zjistili jsme, že transkripční elongační mechanismus zahrnuje interakce mezi N-terminálními doménami transkripčních elongačních faktorů TFIIS (TND) a konzervovanými nestrukturovanými sekvencemi nazývanými "TND-interacting motifs" (TIMs). Mutací jediného TIM v klíčovém proteinu organizujícím tuto síť jsme narušili klíčové proteinové interakce a pozorovali rozsáhlé defekty v dynamice transkripční elongace. Zachování a využití TND poukazuje na jejich kritickou roli při seskupování transkripčního aparátu. Pochopení regulace jednotlivých interakcí TND tak představuje nový výzkumný směr. Naše práce navíc přispívá k dešifrování interakcí mezi neuspořádanými sekvencemi a sbalenými proteinovými doménami.
